Туляремия является одной из эндемичных инфекций для Казахстана. Распространение природных очагов туляремии в Казахстане связано с ландшафтно-географическими особенностями территории, влияющими на формирование очагов возбудителя инфекции. Природные очаги различных типов заболевания зарегистрированы во всех регионах республики, за исключением двух областей. Общая площадь природных очагов туляремии составляет 20,5% территории страны.
Эпидемиологическая и эпизоотическая ситуация по туляремии в Казахстане требует постоянного мониторинга эндемичных очагов возбудителя туляремии с использованием современных методов исследования.
Во всем мире доказательные, воспроизводимые и высокодискриминационные методы генотипирования являются неотъемлемой частью эпидемиологического мониторинга. Это позволяет провести всесторонний анализ распространения заболевания, путей его передачи, филогенетических взаимоотношений, пространственно-временного распределения штаммов, популяционной динамики, а также оперативно выявлять изменчивую вирулентность или устойчивость новых или возникающих биологических агентов. Выполнение указанных основных задач не только имеет особое значение, но и является весьма сложным для высокопатогенного и генетически мономорфного Francisella tularensis.
Международная база данных, накапливающая информацию о циркулирующих генотипах, помогает в изучении эволюционных изменений патогенов и проведении мониторинга на глобальном уровне.
Генетическое разнообразие Francisella tularensis в Казахстане изучено недостаточно.
Целью данной работы является анализ литературы по методам генотипирования, используемым для изучения возбудителя туляремии Francisella tularensis.
В базах данных PubMed, Thomson Reuters, Springer, e.library.ru, Google Scholar и Кокрейн был проведен онлайн-поиск литературы по современным методам генотипирования возбудителя туляремии. Было включено тридцать шесть работ, соответствующих критериям включения.
Мы включили 36 источников литературы, соответствующих критериям включения: работы, демонстрирующие исследования в области генотипирования возбудителя туляремии: мультилокусный анализ (MLVA), полногеномное секвенирование и другие методы исследования. Использовались литературные источники, опубликованные за последние 20 лет.
Из 36 источников были оценены возбудитель туляремии F. Tularensis и методы молекулярного типирования патогенов. Мы оценивали материалы случайным образом, то есть основываясь на важных аспектах. Отобранные элементы данных включали: методы генотипирования, генетическое разнообразие и эволюцию F.Tularensis, результаты MLVA-исследования.
F. tularensis — грамотрицательная бактерия, являющаяся возбудителем туляремии, зоонозного инфекционного заболевания, широко распространенного во многих странах мира. Циркуляция F. Tularensis в природе очень сложна и включает множество млекопитающих-хозяев и членистоногих-переносчиков.
С клинической точки зрения, эти возбудители вызывают у людей заболевания от кожной сыпи до тяжелой пневмонии или сепсиса, приводящего к летальному исходу, в зависимости от пути заражения и типа микроба. F. tularensis включен в программы разработки биологического оружия из-за его высокой летальности при минимальной инфицирующей дозе в 10–50 КОЕ. По данным Центров по контролю и профилактике заболеваний, F. Tularensis относится к препаратам категории А.
На сегодняшний день известны два вида рода Francisella — Francisella tularensis и Francisella philomiragia. Вид F. Tularensis имеет четыре подвида — F. tularensis subsp. tularensis (тип А), F. tularensis subsp. holarctica (тип В), F. tularensis subsp. mediaasiatica и F. tularensis subsp. novicida.
Соответствие нуклеотидных последовательностей 16S рРНК составляет от 98,5 до 99,9%. Даже при высоком уровне гомологии ДНК подвиды демонстрируют существенные различия в вирулентности. Кроме того, каждый подвид характеризуется известным географическим распространением. Например, F. tularensis subsp. Tularensis чаще встречается в Северной Америке, но в последнее время обнаруживается и в Центральной Европе. Подвид F. tularensis subsp. holarctica чаще встречается в Северном полушарии, Европе, Азии, Северной Америке. Штаммы F. tularensis subsp. Mediasiatica были обнаружены на территориях стран Центральной Азии, но в последнее время появились публикации о их появлении в Алтайском крае Российской Федерации. До 2003 года F. tularensis subsp. Novicida был зарегистрирован в Северной Америке, но недавно был обнаружен в Австралии.
В лабораторной практике Казахстана для индикации и идентификации возбудителя туляремии используются микробиологические методы, основанные на определении фенотипических признаков: биохимическая активность, характеристики роста, патогенность для животных, чувствительность к некоторым антибактериальным препаратам.
К недостаткам этих методов, помимо трудоемкости и высокого биологического риска при проведении лабораторных процедур, относится невозможность определения эволюционных связей и филогенетической структуры бактериальной популяции. В связи с этим существует необходимость внедрения методов, основанных на анализе ДНК, которые повысят возможности лабораторий в области биологической безопасности и будут способствовать их развитию.
Для генотипирования F. tularensis было предложено несколько методов, способных различать подвиды на разных уровнях и обладающих дискриминационными возможностями.
Мультилокусное секвенирование (multi locus sequence typing — MLST) основано на прямом определении нуклеотидных последовательностей аллелей достаточного количества «домашних» генов. Высокая воспроизводимость и доступная база данных позволили использовать систему MLST в качестве «золотого стандарта» для определенных патогенов. Тем не менее, традиционный MLST не обеспечивает необходимой дискриминации для штаммов генетически однородных видов, таких как F. tularensis, Y. Pestis и anthracis. Генетическая мономорфность и консервативность генома F. Tularensis, сложность воспроизведения результатов, а также случайная полиморфная амплификация ДНК-метода, основанного на полиндроме повторов, REP-PCR и ERIC-PCR, и полиморфизм длины рестрикционных фрагментов (RFLP) не позволили использовать их на практике.
Генотипирование бактерий методом пульс-гельэлектрофореза (ПГЭФ) широко используется с 80-х годов прошлого века. Использование различных рестриктаз и выбор на основе полногеномных данных улучшили дискриминационные способности, а стандартизация протоколов патогенов повысила воспроизводимость полученных результатов.
Генотипирование штаммов F. tularensis позволяет разделить их на подвиды и субштаммы в соответствии с их географической локализацией и вирулентностью. Тем не менее, трудоемкость, длительность и сложность воспроизведения результатов, необходимость работы с высококачественной ДНК и живыми организмами, а также другие факторы применения ограничивают использование ПГЭФ в повседневной лабораторной практике.
Для генотипирования патогенов широко используется анализ числа вариабельных тандемных повторов в мультилокусе (multilocus variable number tandem repeat analysis – MLVA). Вследствие высокого уровня мутаций количество повторов VNTR в одном локусе варьирует между видами. Это может быть использовано для генотипирования. Для целей генотипирования выбирается участок с определенным количеством тандемных повторов в гипервариабельной области, и используются праймеры, фланкирующие ДНК, выбранную для защиты. Последующее электрофоретическое разделение позволяет определить размер продукта ПЦР и количество повторов. Использование флуоресцентно меченых праймеров позволяет проводить мультиплексирование ПЦР и разделение на генетическом капиллярном анализаторе с очень высокой точностью. Простота выполнения, экономичность, высокая пропускная способность результатов и наличие базы данных генотипов делают технологию MLVA типирования незаменимым инструментом в эпидемиологическом мониторинге циркулирующих штаммов патогенов на местном и мировом уровнях. MLVA обладает очень высокой дискриминацией для генетически мономорфных патогенов, включая Francisella spp. Дискриминационная способность MLVA позволяет дифференцировать подвиды F. Tularensis и географические особенности циркулирующих штаммов.
23 канонических однонуклеотидных полиморфизма (canSNP) были выявлены у 95 штаммов F. Tularensis в ходе тестирования с использованием чиповой технологии и 13 полногеномных штаммов. Этот анализ позволяет дифференцировать 4 подвида F. Tularensis и субштаммы в соответствии с географическими особенностями каждого подвида.
Следует отметить, что субштаммы устанавливают взаимосвязь с помощью данных MLVA [30]. Несмотря на охват филогенетических выборок циркулирующих штаммов, основанных на ПГЭФ, MLVA и canSNP, точная географическая локализация очень затруднена. В связи с этим можно рассмотреть возможность эффективного использования полногеномного секвенирования (WGS) для идентификации штаммов с точной геологией.
Развитие технологий и удешевление секвенирования стали мощным стимулом для развития геномной эпидемиологии. Тем не менее, выделяемое на систему контроля распространения инфекций в Казахстане финансирование не позволяет использовать WGS в качестве стандартного метода генотипирования.
Ункуль Избанова
Кандидат медицинских наук